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Técnica que permite amplificar qualquer porção de DNA fora das células.
Material necessário:
sequências de DNA que se pretende amplificar;
um par de iniciadores (primers);
os quatro tipos de nucleótidos;
uma polimerase DNA (Taq);
solução-tampão que impeça variações de pH e que contenha Mg² , ião essencial para a actividade da polimerase.
Uma reacção de PCR corresponde a um conjunto de ciclos, envolvendo cada um destes ciclos:
Desnaturação da dupla hélice – é conseguida com a incubação do DNA a uma temperatura de 95°C, formando duas cadeias simples a partir de uma dupla cadeia;
Emparelhamento dos iniciadores – diminuição da temperatura aproximadamente para os 55°C, para ocorrer a ligação dos primers;
Polimerização (síntese) de DNA – ocorre a 70°C, temperatura óptima de actividade da Taq polimerase. Esta liga-se na região dos iniciadores, e promove a polimerização, com elongação da cadeia de DNA, servindo a outra como molde.
Este ciclo é repetido dezenas de vezes, para obter milhões de cópias de DNA, em poucas horas e sem intervenção manual. No final, leva à produção de 2^n moléculas de DNA de interesse, em que n representa o número de ciclos.
A Taq polimerase é uma polimerase extraída da Thermus aquaticus, uma bactéria que habita fontes termais com água extremamente quente, resistindo às variações de temperatura e contribuindo significativamente para o sucesso da técnica de PCR (o aquecimento para desnaturar as cadeias de DNA provocava a inactivação definitiva da polimerase, obrigando a adicionar mais enzima por ciclo de aquecimento).
Um dos aspectos mais negativos desta técnica é a grande sensibilidade ``a contaminação com DNA estranho, podendo ocorrer emparelhamento entre os iniciadores e este DNA estranho, amplificando sequências não pretendidas.
Aplicações da técnica:
PCR:
Obtenção de grandes quantidades de DNA em pouco tempo, a partir de uma quantidade muito pequena. Esse DNA pode ser posteriormente utilizado em técnicas de recombinação de DNA ou em fingerprint.
Material necessário:
sequências de DNA que se pretende amplificar;
um par de iniciadores (primers);
os quatro tipos de nucleótidos;
uma polimerase DNA (Taq);
solução-tampão que impeça variações de pH e que contenha Mg² , ião essencial para a actividade da polimerase.
Uma reacção de PCR corresponde a um conjunto de ciclos, envolvendo cada um destes ciclos:
Desnaturação da dupla hélice – é conseguida com a incubação do DNA a uma temperatura de 95°C, formando duas cadeias simples a partir de uma dupla cadeia;
Emparelhamento dos iniciadores – diminuição da temperatura aproximadamente para os 55°C, para ocorrer a ligação dos primers;
Polimerização (síntese) de DNA – ocorre a 70°C, temperatura óptima de actividade da Taq polimerase. Esta liga-se na região dos iniciadores, e promove a polimerização, com elongação da cadeia de DNA, servindo a outra como molde.
Este ciclo é repetido dezenas de vezes, para obter milhões de cópias de DNA, em poucas horas e sem intervenção manual. No final, leva à produção de 2^n moléculas de DNA de interesse, em que n representa o número de ciclos.
A Taq polimerase é uma polimerase extraída da Thermus aquaticus, uma bactéria que habita fontes termais com água extremamente quente, resistindo às variações de temperatura e contribuindo significativamente para o sucesso da técnica de PCR (o aquecimento para desnaturar as cadeias de DNA provocava a inactivação definitiva da polimerase, obrigando a adicionar mais enzima por ciclo de aquecimento).
Um dos aspectos mais negativos desta técnica é a grande sensibilidade ``a contaminação com DNA estranho, podendo ocorrer emparelhamento entre os iniciadores e este DNA estranho, amplificando sequências não pretendidas.
Aplicações da técnica:
PCR:
Obtenção de grandes quantidades de DNA em pouco tempo, a partir de uma quantidade muito pequena. Esse DNA pode ser posteriormente utilizado em técnicas de recombinação de DNA ou em fingerprint.
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