Author: FranciscoMonteiro e HugoMota on
No genoma humano existem sequências de DNA repetitivas que são reconhecidas e cortadas por determinadas enzimas de restrição. Estas enzimas dividem o DNA em fragmentos cujas dimensões e composição em nucleótidos variam de pessoa para pessoa e reflectem as diferenças entre os alelos dos vários loci.
Diferentes fragmentos de DNA movimentam-se de modo diferente quando submetidos a electroforese (técnica em que determinadas moléculas são sujeitas à acção de um campo eléctrico num meio poroso) e o resultado é um padrão de bandas que difere de indivíduo para indivíduo.
Aplicações das técnicas:
DNA fingerprint:
Investigação criminal, forense e histórica – a técnica permite partir de material biológico deixado num local (cabelo, sangue, esperma...) e compará-lo com o dos suspeitos; permite a identificação de cadáveres.
Determinação de paternidade – a comparação das impressões digitais genéticas dos progenitores e do descendente permite excluir a paternidade ou confirmá-la com um elevado grau de certeza.
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Técnica que permite amplificar qualquer porção de DNA fora das células.
Material necessário:
sequências de DNA que se pretende amplificar;
um par de iniciadores (primers);
os quatro tipos de nucleótidos;
uma polimerase DNA (Taq);
solução-tampão que impeça variações de pH e que contenha Mg² , ião essencial para a actividade da polimerase.
Uma reacção de PCR corresponde a um conjunto de ciclos, envolvendo cada um destes ciclos:
Desnaturação da dupla hélice – é conseguida com a incubação do DNA a uma temperatura de 95°C, formando duas cadeias simples a partir de uma dupla cadeia;
Emparelhamento dos iniciadores – diminuição da temperatura aproximadamente para os 55°C, para ocorrer a ligação dos primers;
Polimerização (síntese) de DNA – ocorre a 70°C, temperatura óptima de actividade da Taq polimerase. Esta liga-se na região dos iniciadores, e promove a polimerização, com elongação da cadeia de DNA, servindo a outra como molde.
Este ciclo é repetido dezenas de vezes, para obter milhões de cópias de DNA, em poucas horas e sem intervenção manual. No final, leva à produção de 2^n moléculas de DNA de interesse, em que n representa o número de ciclos.
A Taq polimerase é uma polimerase extraída da Thermus aquaticus, uma bactéria que habita fontes termais com água extremamente quente, resistindo às variações de temperatura e contribuindo significativamente para o sucesso da técnica de PCR (o aquecimento para desnaturar as cadeias de DNA provocava a inactivação definitiva da polimerase, obrigando a adicionar mais enzima por ciclo de aquecimento).
Um dos aspectos mais negativos desta técnica é a grande sensibilidade ``a contaminação com DNA estranho, podendo ocorrer emparelhamento entre os iniciadores e este DNA estranho, amplificando sequências não pretendidas.
Aplicações da técnica:
PCR:
Obtenção de grandes quantidades de DNA em pouco tempo, a partir de uma quantidade muito pequena. Esse DNA pode ser posteriormente utilizado em técnicas de recombinação de DNA ou em fingerprint.
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Os procariontes são organismos muito utilizados em Engenharia Genética como receptores de DNA estranho porque são fáceis de cultivar, têm um crescimento rápido e processos bioquímicos bem conhecidos. No entanto, não processam o RNAm e, quando recebem genes com intrões, estes não são retirados e a proteína produzida não é funcional.
DNA complementar (DNAc) – molécula de DNA sem intrões que é directamente transcrita numa molécula de RNAm funcional. O processo de obtenção de DNAc é o seguinte:
Isola-se uma molécula RNAm funcional das células.
Adiciona-se transcriptase reversa e nucleótidos livres. A transcriptase reversa catalisa a síntese de uma cadeia simples de DNA a partir de um molde de RNAm.
Junta-se uma enzima que degrada o RNAm que serviu de molde e DNA polimerase que catalisa a formação da cadeia complementar do DNA.
O DNAc pode ser inserido através de um vector contendo o promotor e sequências reguladoras.
Todos os DNAc que se sintetizam a partir do RNA podem ser clonados em bactérias, originando uma biblioteca de DNAc, em que toda a informação (genes que se encontravam a ser transcritos – expressos – num dado momento), fica armazenada em bactérias por longos períodos de tempo, desde que sejam fornecidas todas as condições indispensáveis para a sua manutenção.
Aplicações das técnicas:
DNA complementar (DNAc):
Obtenção de cópias de genes que codificam produtos com interesse – torna possível a produção de proteínas humanas por procariontes que podem ser cultivados facilmente em biorreactores.
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Permite combinar na mesma molécula de DNA genes provenientes de fontes diferentes, mas não necessariamente de espécies diferentes, dando origem a uma molécula de DNA recombinante (DNAr).
Baseia-se na utilização de ferramentas moleculares como as enzimas de restrição, as ligases do DNA e os vectores.
Enzimas de restrição – reconhecem determinadas sequências de DNA e cortam a molécula nesses locais. As zonas de restrição correspondem a sequências de DNA curtas e simétricas que se lêem da mesma forma nas duas cadeias na direcção 5'-3'.
As enzimas de restrição são bastante específicas e ocorrem naturalmente em bactérias. Protegem as bactérias dos ataques dos vírus, uma vez que reconhecem e cortam sequências específicas do DNA viral, inactivando-o. O DNA bacteriano está protegido da actividade das enzimas de restrição.
A actividade das enzimas de restrição dá origem a fragmentos de DNA em dupla hélice – fragmentos de restrição - com extremidades em cadeia simples – extremidades coesivas.
Verifica-se complementaridade de bases do DNA nas extremidades coesivas de diferentes fragmentos de restrição obtidos com a mesma enzima.
As extremidades coesivas emparelham através de ligaçõe sde hidrogénio entre bases complementares e podem unir-se pela actividade de ligases do DNA que catalizam a formação de ligações fosfodiéster.
Vector – entidade, constituída por DNA, que transfere o DNA de uma célula ou de um organismo dador para uma célula ou um organismo receptor.
Os vectores mais utilizados são os plasmídeos e os bacteriófagos.
Os plasmídeos são pequenas moléculas circulares de DNA que ocorrem naturalmente em algumas bactérias, leveduras e células vegetais.
Os plasmídeos ligam-se a determinados compostos, tornando-os mais densos, permitindo a sua separação por centrifugação.
Processo de obtenção e expressão de uma molécula de DNAr:
Selecciona-se uma molécula de DNA dadora, contendo o gene com interesse que se pretende transferir e clonar, e um vector adequado.
A molécula de DNA e o vector são tratados com a mesma enzima de restrição, que corta as duas moléculas em regiões com a mesma sequência de nucleótidos.
Misturam-se os fragmentos de restrição da molécula de DNA e o vector e juntam-se ligases do DNA. O vector e os fragmentos de restrição emparelham pelas extremidades coesivas, que são complementares, e a ligase estabelece a ligação.
O vector, contendo o DNA dador, é transferido para uma célula ou organismo receptor.
O DNA dador é incorporado no genoma da célula ou organismo receptor, que passa a possuir um DNA recombinante.
Um meio selectivo ou testes químicos permitem identificar as células que exprimem o gene desejado. No processo descrito formam-se fragmentos de restrição que não têm o gene desejado e nem todas as células receptoras incorporam o DNA dador.
Aplicação das técnicas:
DNA recombinante(DNAr):
Investigação fundamental: torna possível isolar genes de organismos complexos e estudar as suas funções a nível molecular.
Obtenção de OGM: os OGM são organismos em cujo genoma foram introduzidos genes que conferem características vantajosas. Os OGM
Os animais transgénicos, normalmente, são produzidos através de microinjecção de DNA de um determinado gene em células de um ovo fertilizado, ou através de células colocadas no útero de uma fêmea, decorrendo assim o seu desenvolvimento.
Os OGM são utilizados para:
produção de alimentos em maior quantidade e qualidade;
produção de grandes quantidades de substâncias com aplicação médica ou farmacêutica, como a insulina, hormona do crescimento ou factores de coagulação sanguínea;
produção de substâncias com aplicação industrial;
biorremediação – modificação de organismos no sentido de degradarem poluentes.
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O cancro é uma doença genética que resulta da perda de controlo do ciclo celular. A divisão de uma célula com mais frequência do que o normal dá origem a uma população de células em proliferação descontrolada e forma uma massa de células ou tumor.
Características das células cancerosas:
- são pouco especializadas (desdiferenciadas) e com forma arredondada;
- dividem-se continuamente;
- invadem os tecidos adjacentes;
- podem instalar-se noutros locais do organismo, onde chegam através da corresnte sanguínea ou linfática, originando novos tumores que se chamam metástases.
Na maior parte das situações, as mutações ocorrem em células somáticas ao longo da vida, embora também possam ocorrer em células germinativas. Geralmente, é um acumular de mutações que desencadeia o desenvolvimento de um cancro.
Genes relacionados com o aparecimento de cancro e suas mutações:
Oncogenes:
-Resultam da mutação de proto-oncogenes.
-Os proto-oncogenes codificam proteínas que estimulam o crescimento e a divisão celular e têm uma função essencial nas células normais, por exemplo, durante o desenvolvimento embrionário e na reparação de tecidos lesados.
- Quando indevidamente activados, promovem uma proliferação celular excessiva que conduz ao desenvolvimento de um cancro.
- A activação de um oncogene pode resultar de diferentes tipos de mutações:
- Substituição de bases no DNA, e consequente alteração na sequência de aminoácidos da proteína formada, que resulta numa proteína com maior actividade ou resistente à degradação;
- Amplificação do proto-oncogene - Traduz-se numa maior quantidade do produto codificado pelo gene;
- inversões ou translocações que levam à alteração do local que o proto-oncogene ocupa no genoma. Se o proto-oncogene for deslocado para junto de um gene activamente transcrito ou para junto de um DNA viral, a sua taxa de transcrição também aumenta.
Genes supressores de tumores:
- Os produtos destes genes inibem a divisão celular, impedindo que as células se multipliquem descontroladamente.
- Os genes supressores de tumores podem estar na origem do cancro quando sofrem mutações como as seguintes:
delecções, que causam a sua perda;
substituição de bases do DNA que resulta numa proteína onde se verifica perda de função relativamente à proteína normal.
Genes que codificam proteínas reparadoras do DNA:
- As mutações nestes genes permitem a acumulação de outras mutações, algumas das quais em proto-oncogenes ou genes supressores de tumores.
- Os agentes mutagénicos podem activar oncogenes ou desactivar genes supressores de tumores e causar cancro.
- As infecções por vírus contribuem para o aparecimento de cancro pela integração do material genético do vírus no DNA das células afectadas. O DNA viral pode ser inserido num local onde destrua a actividade de um gene supressor de tumores ou converta um proto-oncogene num oncogene.
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Qualquer modificação ou alteração brusca de genes ou de cromossomas, podendo provocar uma variação hereditária ou uma mudança no fenótipo. A mutação pode produzir uma característica favorável num dado ambiente e desfavorável noutro.
Classificação das mutações:
- Génicas – alteram a sequência de nucleótidos do DNA, por substituição, adição ou remoção de bases. Podem conduzir à modificação da molécula de RNAm que é transcrita a partir do DNA e, consequentemente, à alteração da proteína produzida, o que tem, geralmente, efeitos no fenótipo.
- Cromossómicas – traduzem-se numa alteração da estrutura (mutação cromossómica estrutural) ou do número (mutação cromossómica numérica) de cromossomas. Podem afectar uma determinada região de um cromossoma, um cromossoma inteiro ou todo o complemento cromossómico de um indivíduo.
As mutações podem ocorrer em células somáticas ou germinativas:
- Mutação somática – ocorre durante a replicação do DNA que precede uma divisão mitótica. Todas as células descendentes são afectadas, mas podem localizar-se apenas numa pequena parte do corpo. As mutações somáticas estão na origem de certos cancros. Não são transmitidas à descendência.
- Mutação nas células germinativas – ocorre durante a replicação do DNA que precede a meiose. A mutação afecta os gâmetas e todas as células que deles descendem após a fecundação – é transmitida à descendência.
As mutações são importantes do ponto de vista evolutivo. São as mutações que dão origem à variabilidade de indivíduos de uma população sobre a qual actua a selecção natural.
As mutações podem ocorrer espontaneamente ou podem ser induzidas por exposição a um agente mutagénico.
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A regulação génica, permite à célula controlar a sua estrutura e função e é a base para a diferenciação celular e morfogénese, bem como para a versatilidade e adaptatibilidade de qualquer organismo ou célula ao ambiente em que se encontra. O controlo molecular exercido a nível da expressão dos genes resulta em alterações na quantidade e/ou momento em que os genes são expressos. A expressão génica diferencial de conjuntos de genes, em células com o mesmo genótipo, leva à produção de proteínas específicas, características de um estádio particular do desenvolvimento, ou de determinado tipo de célula diferenciada. Durante a expressão génica, são várias as etapas sujeitas a regulação, designadamente, modificação química e estrutural do DNA ou cromatina, transcrição, tradução, modificação pós-transcricional, transporte de RNA, degradação de RNA e modificações pós-traducionais.
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